Die CRISPR-Therapie in menschlichen Lungenchips ist vielversprechend gegen Influenza

Das Influenza-A-Virus (IAV) war die Ursache von sechs großen Grippepandemien, die weltweit für 50 bis 100 Millionen Todesfälle verantwortlich sind. Allein in den USA wird geschätzt, dass IAV-Infektionen trotz saisonal aktualisierter Impfstoffe immer noch zu 140.000 bis 710.000 Krankenhauseinweisungen und 12.000 bis 52.000 Todesfällen pro Jahr führen.

Die Entwicklung antiviraler Behandlungen gegen IAV – oder auch nachhaltigerer Impfansätze – stellte eine große Herausforderung dar, da IAV durch die Veränderung seiner genetischen Ausstattung schnell eine Resistenz dagegen entwickelt. Bisher war seine Fähigkeit, zu „mutieren“, seine genetischen Informationen neu zu ordnen oder sie sogar mit denen anderer IAV-Viren, die dieselbe Zelle infizieren, neu zu kombinieren, eine unüberwindbare Herausforderung für Arzneimittelentwickler und stellt ein ständiges Risiko für die Entstehung neuer pandemischer Stämme dar.

Die Suche nach einer wirksamen Waffe gegen die sich ständig verändernde genetische Ausstattung von IAV wurde durch das Fehlen eines geeigneten Menschen behindert in vitro Modell zum Testen neuer Behandlungsmethoden. Diese Herausforderung wird durch die Tatsache verschärft, dass Tiermodelle der IAV-Infektion menschliche Immunantworten nicht genau nachbilden können und die Medikamentenabgabe an menschliches Lungengewebe unter anderen Bedingungen erfolgt als bei Tieren. Es werden neue Ansätze auf Basis der CRISPR-Genbearbeitungstechnologie erforscht, aber die Zielsequenzen sind so spezifisch für den Menschen, dass Studien in Tiermodellen nicht sinnvoll durchgeführt werden können.

Nun ging eine neue Gemeinschaftsstudie des Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering der Harvard University diese Herausforderungen an, indem sie gleichzeitig ein mikrofluidisches „atmendes“ menschliches Lungenalveolen-Chip-Modell (Lung Chip) für IAV-Infektionen nutzte, das in der Gruppe von Gründungsdirektor Donald Ingber, MD, Ph.D., entwickelt wurde, und Medikamentenverabreichungsplattformen, die von stellvertretender Direktorin Natalie Artzi, Ph.D., weiterentwickelt wurden. und ihrer Gruppe sowie modernste CRISPR-Technologie. Das Team erreichte dies, indem es eine CRISPR-Maschinerie entwarf, die auf eine stark konservierte Sequenz im IAV-Genom abzielte, diese in winzige Nanopartikel mit Affinität zu Lungenepithelzellen verpackte und die geladenen Partikel an Lungenepithelzellen lieferte, die einen Mikrofluidikkanal im Lungenchip auskleideten, die mit einem pandemischen IAV infiziert waren. Dadurch wurde die Viruslast im manipulierten Gewebe nach einer einzigen Verabreichung der Behandlung um mehr als 50 % reduziert und die durch das Virus verursachte Entzündungsreaktion des Wirts wurde deutlich abgeschwächt. Wichtig ist, dass im System nur minimale Off-Target-Effekte auftraten, wie die transkriptomische Analyse ergab. Somit ermöglicht dieses Organ-Chip-Modell, das die menschliche IAV-Infektion besser nachahmt als andere präklinische Modelle, eine klinisch relevantere Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von CRISPR-RNA-Therapien als frühere Ansätze. Die Ergebnisse werden veröffentlicht in Labor auf einem Chip.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass das menschliche Lungenchip-Modell der IAV-Infektion ein äußerst wertvolles präklinisches Testfeld für CRISPR-RNA-Therapeutika ist, die breit über Virusstämme hinweg wirken, da es nicht nur auf für den Menschen relevante Weise über ihre Wirksamkeit berichtet, sondern, was noch wichtiger ist, auch die Bewertung ihrer potenziellen Off-Target-Wirkungen ermöglicht, die unserer Meinung nach bisher minimal sind. Angesichts der hohen Wahrscheinlichkeit zukünftiger Pandemien und natürlicher saisonaler Schwankungen von IAV könnten solche pan-IAV-antiviralen Behandlungen uns helfen, dem Virus einen Schritt voraus zu sein und möglicherweise Tausende von Leben zu retten.“

Donald Ingber, MD, Ph.D.

Ingber ist auch der Judah Folkman Professor für Gefäßbiologie an der Harvard Medical School und am Boston Children’s Hospital sowie am Hansjörg Wyss Professor für Biologisch inspirierte Ingenieurwissenschaften bei SEAS.

Wenn CRISPR auf Organchips trifft

Die Bemühungen, antivirale Behandlungen gegen IAV zu entwickeln, stützten sich bisher stark auf Tiermodelle wie Mäuse, Hamster und Frettchen, die experimentell mit IAV-Stämmen infiziert werden können, unabhängig davon, ob es sich um laboradaptierte oder klinisch relevante menschliche Isolate handelt, und grippeähnliche Symptome entwickeln können. Allerdings weisen sie mehrere Mängel auf: Sie unterscheiden sich vom Menschen in Anatomie, Physiologie und genetischem Design, was sich auch auf die Effizienz auswirken könnte, mit der das Virus in Lungenzellen eindringt und sich dort repliziert. Wichtig ist auch, dass ihr Immunsystem in wichtigen Aspekten anders funktioniert als das des Menschen; und die Medikamentenabgabe an ihr Lungengewebe stellt andere Anforderungen als die Medikamentenabgabe an menschliches Lungengewebe.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, startete Ingbers Gruppe mit Unterstützung des National Center for Advancing Translational Sciences der National Institutes of Health (NIH) im Jahr 2017 ein vom NIH finanziertes Human Organ Chip-Projekt, um die menschliche IAV-Infektion genauer zu modellieren. Das Team baute auf der Organ-Chip-Plattform des Wyss Institute auf und wurde mit Unterstützung der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) weiterentwickelt. Der im Rahmen dieser Plattform entwickelte menschliche Lungenchip, der die winzigen Luftsäcke (Alveolen) der Lunge nachahmt, die den Austausch von Sauerstoff und CO2 ermöglichen und auch den Ort der IAV-Infektion darstellen, ermöglichte es dem Team im Jahr 2022, eine menschenähnliche IAV-Infektion zu modellieren und neuartige Therapeutika zu entdecken, die die erste Immunantwort (angeborene Immunität) infizierter Wirte modulieren, um lebensbedrohliche Lungenentzündungen zu verhindern. Einige dieser Therapeutika wurden in klinische Studien am Menschen überführt, um ihre Wirkung bei Patienten mit COVID-19 zu bewerten.

Beim Lung Chip wird in einem von zwei parallel verlaufenden Kanälen eines mikrofluidischen Chips in der Größe eines Memory Sticks ein menschliches primäres Alveolarepithel erzeugt, während im anderen Kanal menschliche Lungengefäß-Endothelzellen kultiviert werden, um ein unterstützendes Blutgefäß nachzuahmen. Beide Kanäle sind durch eine dünne poröse Membran getrennt, um den freien Austausch von Molekülen und Gasen zu ermöglichen, wie es in den Alveolen der menschlichen Lunge geschieht. Durch das Fließen von Kulturmedium durch den „Gefäßkanal“ können die Forscher den natürlichen Blutfluss in Alveolen simulieren; Und indem Luft durch den „Epithelkanal“ zirkuliert und das künstliche Gewebe zyklisch gedehnt und entspannt wird, indem zwei hohle Seitenkammern, die die beiden Kanäle flankieren, unter Druck gesetzt und entlüftet werden, können die Forscher die „Luft-Flüssigkeits-Interphase“ der Atmung der Lunge nachahmen. Um eine Grundlage für ihre neue Studie zu schaffen, verwendeten sie dieses System und fügten über den Epithelkanal IAV-Viruspartikel verschiedener Stämme hinzu, darunter den pandemischen H3N2-Stamm, der 1968 eine globale Grippepandemie mit 1 Million Todesfällen verursachte. Dadurch wurden viele der Feinheiten einer IAV-Infektion originalgetreu nachgebildet, einschließlich des Viruseintritts und der Virusreplikation in Lungenzellen, der Freisetzung neuer Viren sowie der durch die Infektion ausgelösten Entzündungs- und Immunreaktionen.

Die neue Studie ging jedoch noch einen Schritt weiter und zeigte, dass sie einen beispiellosen Wert als wirksames präklinisches Instrument zur Entwicklung einer neuen Klasse antiviraler Medikamente hat, die die CRISPR-Technologie nutzen, die auf Gensequenzen abzielt, die sehr speziesspezifisch sind. Das Gen-Editing-System wurde bereits als antivirale Plattform gegen IAV erforscht, jedoch hauptsächlich in Schalenkulturen und Tiermodellen. Wichtige translationale Herausforderungen wie die gewebespezifische Abgabe von CRISPR an das menschliche Gewebe und mögliche Off-Target-Effekte der auf Viren gerichteten CRISPR-Maschinerie auf die Genexpression menschlicher Lungenzellen konnten bisher nicht untersucht werden.

Mitglieder von Ingbers Team, darunter Yuncheng Man, Ph.D., der Erstautor und Postdoktorand in Ingbers Labor am Boston Children’s Hospital, entwickelten eine Version der CRISPR-Maschinerie, die zwei CRISPR-RNAs (crRNAs) verwendet, die auf zwei unveränderliche Regionen im sogenannten Polymerase Basic 1 (PB1)-Gen von IAV abzielen, die ihrer Meinung nach in der überwiegenden Mehrheit der IAV-Viren, die Menschen infizieren, konserviert sind. Als die Forscher die crRNAs zusammen mit einem mRNA-Molekül einführten, das für das RNA-zerstörende Cas13-Enzym kodiert, führten die crRNAs Cas13 zur PB1-Zielsequenz verschiedener IAVs, mit denen sie kultivierte Lungenzellen infizierten. Dies führte zu einer Reduzierung der PB1-RNA-Spiegel um mehr als 80 %.

CRISPR: Unterzeichnet, versiegelt und geliefert

Um die therapeutischen Wirkungen ihrer Pan-IAV-CRISPR-Therapie zu untersuchen, musste das Team sie in Partikel verpacken, um sie vor unspezifischem Abbau zu schützen und eine effizientere Abgabe an die Lungenepithelzellen im Lung Chip zu ermöglichen. „Es ist eine eigene Herausforderung, den richtigen Partikeltyp zu finden, der eine effiziente Verpackung der therapeutischen RNA-Moleküle und deren Internalisierung durch menschliches Lungenalveolargewebe ermöglicht“, sagte Man.

Zu den weiteren Autoren der Studie gehörten Ryan Posey, Haiquing Bai, Amanda Jiang, Pere Dosta, Diana Ocampo-Alvarado, Robert Plebani, Jie Ji und Chaitra Belgur. Die Studie wurde von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) im Rahmen der Kooperationsvereinbarung HR0011-22-2-0017 und dem Wyss Institute der Harvard University unterstützt.

Quellen: