Die MIDAS-Plattform beschleunigt das Protein-Engineering durch schnelles PCR-basiertes Screening

Proteine ​​sind lebenswichtig – und für die Industrie. Es gibt unzählige Proteine, die zur Behandlung und sogar Heilung schwerer Krankheiten und zellulärer Funktionsstörungen entwickelt werden könnten. Industrielle Anwendungen sind ähnlich vielversprechend, wobei Proteine ​​zunehmend als Enzyme in der Lebensmittelherstellung und in Waschmitteln für Verbraucher eingesetzt werden.

Während KI dabei helfen kann, Verbesserungen vorzuschlagen, muss jedes neue Protein dennoch in der realen Welt erstellt und auf seine Leistung getestet werden. Es handelt sich um einen arbeitsintensiven Prozess, bei dem die DNA-Anweisungen für jedes Protein in Hefen oder Bakterien erstellt und einzelne Klone für die Proteinproduktion und -tests gezüchtet werden. Dies kann für ein einzelnes Protein von Interesse viele Tage dauern und sogar noch länger, wenn das Protein in Säugetierzellen getestet werden muss, ein Prozess, der die Entnahme von DNA aus Mikroben für den Transfer in die Säugetierzellen erfordert.

In einer neuen Arbeit sagen Michael Z. Lin, Professor für Neurobiologie und Bioingenieurwesen an den Fakultäten für Ingenieurwesen und Medizin, und die Doktoranden Yan Wu im Bioingenieurwesen und Pengli Wang* im Chemieingenieurwesen, dass sie den zeitintensiven Proteinaufbau- und Testprozess auf nur 24 Stunden verkürzt haben. Sie nennen ihren Ansatz MIDAS für Microbe-Independent Deep Assembly and Screening. MIDAS könnte die biologische Forschung in Bereichen von der Onkologie bis zu den Umweltwissenschaften rasch beschleunigen. Die Studie zur Einführung von MIDAS erscheint in der Zeitschrift Molekulare Systembiologie.

„Die grundlegenden Fragen der Molekularbiologie bleiben bestehen: Wie stellen wir bessere Proteine ​​her und wie verstehen wir, was ein Protein funktioniert?“ Sagt Lin. „Diese Arbeit erfordert wertvolle Zeit und Ressourcen, aber wir haben einen Weg gefunden, diese Anforderungen drastisch zu reduzieren.“

Im Kreis drehen

Lin und Kollegen haben den traditionellen mikrobiellen Aufbauprozess übersprungen, indem sie eine genetische Replikationstechnik namens Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendeten. Durch PCR können lineare DNA-Segmente sehr schnell zu Millionen oder Milliarden Kopien amplifiziert werden. Durch die Verwendung von PCR zum Aufbau vollständiger Gene, die von Säugetierzellen zur Expression eines bestimmten Proteins verwendet werden, umgingen sie die Notwendigkeit einer mikrobiellen Klonierung und eines DNA-Transfers. Die durch PCR erzeugten Genvariationen können zur Funktionsanalyse direkt in Säugetierzellen übertragen werden. Die einzige Voraussetzung für das PCR-Verfahren sind kurze DNA-Stränge, sogenannte „Primer“, die für die Lieferung am nächsten Tag bestellt werden können.

Mit MIDAS können wir morgens PCR-Primer erhalten, mittags die notwendigen Gene zusammenbauen und am späten Nachmittag die Gene in Zellen übertragen, um zu beobachten, wie die Proteine ​​funktionieren. Und wir können das alles für Hunderte oder Tausende von Proteinvarianten gleichzeitig tun.“

Yan Wu, Co-Erstautor

Wenn Forscher beim traditionellen Protein-Engineering eine vielversprechende Variante identifizieren, müssen sie das Gen, das das Protein exprimiert, zusammensetzen und in eine zirkuläre genetische Struktur, ein sogenanntes Plasmid, klonen. Anschließend müssen sie die modifizierten Plasmide in die DNA von Bakterien oder Hefen übertragen, um geeignete Mengen jeder einzelnen Plasmid-DNA zu produzieren, die dann zur Validierung in Säugetierzellen übertragen werden müssen.

Dieser Klon-und-Übertragungsprozess ist mühsam, langsam und teuer und schränkt die Anzahl der Varianten, die sinnvoll evaluiert werden können, erheblich ein. MIDAS ändert dieses Kalkül. Die wichtigste Erkenntnis von Lin und seinem Team bestand darin, die zirkulären Plasmide zu beseitigen, die mit der PCR inkompatibel sind. Stattdessen behandeln sie DNA als lineare Information, die sich ideal für die PCR eignet. Dies ermöglicht es ihnen, Hunderte von Genvarianten gleichzeitig zusammenzustellen und sie in großen Mengen direkt in Säugetierzellen zu übertragen, um schnell und kostengünstig die leistungsstärksten zu identifizieren.

„Wir kamen zu dem Schluss, dass die kreisförmige Struktur von Plasmiden nichts Magisches ist“, sagt Lin. „Für die PCR braucht man nur die genetischen Daten. Das war der Moment der Inspiration.“

Ein praktischer Test von 384 Varianten mit MIDAS erforderte etwa vier Stunden praktische Laborarbeit und etwa 2.000 US-Dollar an Reagenzien. Mit den bestehenden Methoden würde ein erfahrener Forscher etwa 192 Stunden und etwa 20.000 US-Dollar an Reagenzien benötigen, um nur 24 Varianten zu bewerten. Die Forscher berechnen, dass MIDAS fast 50-mal schneller ist und ein Zehntel der Kosten von Klon-basierten Ansätzen beträgt.

Sofortige Wirkung

MIDAS könnte unmittelbare Auswirkungen auf die biologische Forschung in der Praxis haben. Erstens sollte es wichtige Enzym- und Biosensorstudien beschleunigen, sagen die Forscher. Zweitens könnte es die automatische Produktion von PCR-Primern verbessern, die sich ideal für moderne Liquid-Handling-Roboter eignen, die Hunderte neuer Proteine ​​gleichzeitig bewerten können. Schließlich und vielleicht am wichtigsten glauben sie, dass MIDAS bessere und größere Sequenz-Fitness-Datensätze liefern könnte, die das datenintensive KI-Training verbessern und zu immer leistungsfähigeren molekularen Designmodellen führen könnten.

„Wir haben MIDAS nicht nur verwendet, um die leistungsstärkste Version eines Proteins zu finden, sondern auch, um zu verstehen, wie gut eng verwandte Varianten funktionieren. Diese Informationen können wir zum Trainieren von KI-Modellen verwenden“, sagt Co-Erstautorin Pengli Wang. „MIDAS ist so einfach, dass wir damit sehr schnell große Datensätze erstellen können.“

Mit Blick auf die Zukunft glaubt Lin, dass MIDAS tiefergehende kombinatorische Suchen, eine engere Integration mit der Robotik und die Generierung von Gensequenz- und molekularen Fitnesskarten ermöglichen könnte, um verbesserte Modelle für maschinelles Lernen zu unterstützen, die das rechnerische Design und die experimentelle Validierung vorantreiben können.

„MIDAS ist bei der Validierung in der Praxis mindestens eine Größenordnung schneller“, sagt Lin. „Es verkürzt den technischen Design-Build-Test-Zyklus für Proteine ​​auf nur ein paar Tage und wir glauben, dass es schnelle Fortschritte in der KI-inspirierten Molekularbiologie vorantreiben könnte.“

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