Verfolgung des Alterungsprozesses über mehrere zehn Millionen einzelne Zellen hinweg

Während vieles über den Alterungsprozess rätselhaft ist, bleibt der Wandel im Laufe der Zeit sein Eckpfeiler. Die biologischen Veränderungen, die mit dem Altern einhergehen, finden scheinbar in vielen Zellen des Körpers statt.

Das Problem ist, dass wir Dutzende Milliarden Zellen haben und die Veränderungen in den meisten dieser Zellen unbekannt sind, teilweise aufgrund traditioneller technischer Einschränkungen.

Aus diesem Grund hat Junyue Cao von Rockefeller eine Reihe von Hochdurchsatz-Tools zur Genomanalyse einzelner Zellen entwickelt, mit denen untersucht werden kann, wie sich das Altern gleichzeitig auf den molekularen Zustand von mehreren zehn Millionen Zellen im Gehirn auswirkt.

Jetzt hat Caos Labor für Einzelzellgenomik und Populationsdynamik zwei neue Werkzeuge und Konzepte zur Untersuchung der molekularen Veränderungen, der Genexpression und der interzellulären Dynamik des Alterns entwickelt. In Artikeln veröffentlicht in Naturneurowissenschaften Und Zellgenomik, Cao und sein Team beschreiben jede der neuen Technologien sowie die biologischen Erkenntnisse, die sie bereits erbracht haben.

Diese Ansätze gehen im Wesentlichen zwei unterschiedliche Wege zum Verständnis verschiedener Elemente der Zelldynamik und der sich verändernden molekularen Prozesse, die mit dem Altern einhergehen.“

Junyue Cao, Assistenzprofessor, Rockefeller University

Molekulare Nachbarn

Caos Labor ist auf die Entwicklung neuer Techniken der Hochdurchsatz-Einzelzellsequenzierung spezialisiert, die die genetische Expression und Molekulardynamik von Millionen einzelner Zellen gleichzeitig aufdeckt.

Während diese Methoden für verschiedene Analysen verwendet werden können, konzentriert sich Caos Labor auf das Altern. Sein Team hat zuvor Einzelzellsequenzierung eingesetzt, um seltene Gehirnzelltypen zu identifizieren, zu verfolgen, wie Gehirnzellen altern, die Zellen zu bestimmen, die am anfälligsten für altersbedingten Rückgang sind, und zu entdecken, dass Altern ein Entwicklungsstadium sein kann, das durch spezifische molekulare Signale ausgelöst wird.

Die beiden neuen Ansätze, die Caos Labor entwickelt hat, IRISeq und EnrichSci, befassen sich mit der Zellalterung aus unterschiedlichen Blickwinkeln.

„IRISeq nutzt die jüngsten Entdeckungen, die zeigen, dass DNA wie eine Art molekularer Barcode oder sogar ein Lineal fungieren und aufzeichnen kann, welche Moleküle nahe beieinander liegen“, sagt Abdulraouf Abdul, MD-Ph.D. Student in Caos Labor. „Seit Jahrhunderten verlassen sich Wissenschaftler auf Mikroskope, um Gewebe zu untersuchen und zu verstehen, wie Zellen organisiert sind. Wir fragten uns, ob DNA selbst zur Kartierung ganzer Gewebe verwendet werden könnte, ohne überhaupt ein Mikroskop zu verwenden?“

Die Technik wurde genau dafür entwickelt. Unter der Leitung von Abdul und Weirong Jiang, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter im Cao-Labor, entwickelte das Team einen optikfreien Hochdurchsatzansatz, der Millionen von barcodierten, mikrometergroßen Kügelchen verwendet, um lokale Genexpressionsinformationen im gesamten Gewebe zu erfassen. Die Kügelchen tauschen DNA-basierte Signale mit benachbarten Kügelchen aus, sodass Forscher herausfinden können, wo sich Zellen im Gewebe befinden – und das alles ohne Mikroskop. Abdul und seine Kollegen beschrieben die Arbeit in Naturneurowissenschaften.

„Mit IRISeq können wir das Layout von Geweben auf verschiedenen Detailebenen nachbilden – fast so, als würden wir eine Karte vergrößern und verkleinern –, ohne jemals ein einziges Bild aufzunehmen. Das bedeutet, dass wir sehr große Gewebestücke oder viele Gewebeabschnitte auf eine Weise untersuchen können, die mit herkömmlichen Bildgebungsmethoden viel schwieriger oder teurer wäre“, sagt er. „Im Wesentlichen haben wir die Sequenzierung zu einer neuen Art, Biologie zu ‚sehen‘, zu einem Bruchteil der Kosten gemacht.“

Cao fügt hinzu: „Wir können diese Karteninteraktion verwenden, um zu sehen, wie die Zellen während des Alterungsprozesses durch ihre externen Zellinteraktionen angetrieben werden. Damit können die Interaktionen von praktisch zwei oder mehr Zelltypen an einer beliebigen Stelle im Gehirn gleichzeitig untersucht werden.“

Mit diesem Ansatz kartierte das Team entzündliche Zellumgebungen im alternden Gehirn. Sie fanden heraus, dass entzündliche Subtypen von Mikroglia, Oligodendrozyten und Astrozyten dazu neigen, sich in der weißen Substanz zusammenzuballen und miteinander zu interagieren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die weiße Substanz eine besonders gefährdete Region des alternden Gehirns sein könnte, in der krankheitsbedingte Zellzustände entstehen und sich gegenseitig verstärken.

Sie fanden beispielsweise heraus, dass Immunzellen, sogenannte Lymphozyten, auf ganz spezifische Weise eine wichtige Rolle dabei spielen, Entzündungen im alternden Gehirn voranzutreiben.

„Ihre Aktivität konzentriert sich auf bestimmte Regionen, insbesondere in der Nähe der mit Flüssigkeit gefüllten Räume des Gehirns, die als Ventrikel bekannt sind“, sagt Abdul. „Ohne räumliche Informationen wäre diese Art von lokalisierter Immunaktivität leicht zu übersehen gewesen.“

„Wenn man weiß, welche Zelltypen sich zusammenballen und wo sie sich zusammenballen, kann dies potenzielle Angriffspunkte für Anti-Aging-Interventionen darstellen“, sagt Cao.

Veränderungen an unerwarteten Orten

Die zweite, EnrichSci genannt, veröffentlicht in Zellgenomikist eine Einzelkern-RNA-Sequenzierungsmethode, die zunächst auf seltene, aber biologisch relevante Zellen in einer gemischten Zellpopulation abzielt und diese isoliert, wodurch der Prozentsatz des Zielzelltyps in der Probe erhöht wird. Nach der Anreicherung der seltenen Zielzellen untersucht EnrichSci dann die molekulare Programmierung jeder Zelle.

Die Forscher verwendeten EnrichSci im Gehirn alternder Mäuse, um seltene Zellpopulationen anzureichern, die sie zuvor als besonders anfällig für problematische Veränderungen während des Alterns identifiziert hatten, darunter Subtypen von Oligodendrozyten, die ausschließlich im Zentralnervensystem vorkommen. Diese Zellen umhüllen neuronale Axone im Gehirn und Rückenmark und werden mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Bei diesen alternden Subtypen entdeckten die Forscher Veränderungen sowohl in der Genexpression als auch in einflussreichen genetischen Elementen, den sogenannten Exons, die für die posttranskriptionelle Regulation von Genen von entscheidender Bedeutung sind.

„Exons sind die Teile von Genen, die die reifen RNA-Transkripte bilden, die entweder in Proteine ​​übersetzt werden oder anderen biologischen Funktionen dienen“, beschreibt Erstautor Andrew Liao, ein MD-Doktorand in Caos Labor.

Die von ihnen identifizierten exonischen Veränderungen zeigten, dass die posttranskriptionelle Regulierung eine wichtige Rolle bei der Alterung von Oligodendrozyten spielt und neue Angriffspunkte für die Modulation dieser Veränderungen bei der altersbedingten Neurodegeneration bieten könnte.

„Überraschenderweise haben wir auch herausgefunden, dass sich die Expression vieler Gene während des Alterungsprozesses nicht wesentlich verändert, ihre Exons jedoch schon“, fügt Cao hinzu. „Diese Veränderungen standen im Zusammenhang mit dem alternativen Spleißen, einem Schlüsselmechanismus zur Schaffung verschiedener Proteinfunktionen. Aber solche Veränderungen können auch mit vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht werden.“

Jenseits des Alterns

Die Forscher hoffen, dass ihre Techniken sowohl als klinische als auch Forschungsinstrumente zur Diagnose von Krankheiten und zur Entdeckung neuer Biologie bei einem breiten Spektrum von Erkrankungen dienen.

„Wir skalieren IRISeq bereits, um Alterung und pharmakologische Eingriffe in einem Ausmaß zu untersuchen, das bisher nicht möglich war. Im Mittelpunkt dieser Vision steht die Idee, dass Zellen nicht isoliert agieren – ihr Verhalten hängt davon ab, wo sie sich befinden und welche anderen Zellen sie umgeben“, sagt Abdul. „Die Untersuchung von Zellen ohne diesen Kontext ist wie das Lesen einzelner Wörter aus einem Buch, nachdem die Seiten auseinandergerissen wurden. Durch die Erhaltung der räumlichen Beziehungen zwischen Zellen ermöglicht IRISeq die Untersuchung, wie Gewebe funktionieren, sich verändern und auf Krankheiten reagieren, und zwar über größere Stichprobenmengen und breitere Kontexte.“

Liao hofft, EnrichSci zu erweitern, um gemeinsam die Zugänglichkeit von RNA und Chromatin zu profilieren. „Ein solcher Co-Assay wäre in der Lage, Gen- und Exon-Expressionsänderungen sowie die ihnen zugrunde liegenden epigenetischen Veränderungen zu erfassen“, sagt er. „Wir hoffen, diese Methode anwenden zu können, um die altersbedingten Veränderungen in Oligodendrozyten und anderen gefährdeten Zelltypen bei altersbedingter Neurodegeneration weiter zu untersuchen.“

Cao sagt, dass ihre neuen Techniken zur Untersuchung der Zelldynamik in vielen biologischen Kontexten eingesetzt werden können. „Während sich mein Labor auf die Zellpopulationsdynamik im Zusammenhang mit dem Altern konzentriert, können diese Techniken für jedes Krankheitsmodellsystem verwendet werden. Beispielsweise kann IRISeq verwendet werden, um die Interaktionen von Immunzellen während des Krebsfortschrittsprozesses zu untersuchen, und EnrichSci kann posttranskriptionelle Veränderungen beleuchten, die am Krankheitsfortschritt beteiligt sein könnten.“

Quellen: