Forscher nutzen Kobratoxine, um ein membranstörendes antimikrobielles Peptid zu entdecken.

Eine computergestützte Untersuchung der Kardio-Toxine von Kobras hat 14 von Gift inspirierten Peptiden strukturelle, antibakterielle und Toxizitätstests unterzogen. Dies bietet einen rigorosen Test dafür, wie weit die KI-gestützte Peptidentdeckung gehen kann.

In einer aktuellen Studie im Journal NPJ Drug Discovery wurden antimikrobielle Peptidkandidaten identifiziert und bewertet, die aus den Kardio-Toxinen von Kobras stammen. Dabei wurden computergestützte Methoden, maschinelles Lernen zur Priorisierung und experimentelle Screening-Tests eingesetzt, um einen giftinspirierenden Ansatz zur Entdeckung antimikrobieller Medikamente zu testen.

Fortschritte und Herausforderungen in der Entdeckung von auf Gift basierenden antimikrobiellen Peptiden

Schlangengifte stellen eine vielfältige Quelle von bioaktiven Molekülen dar, die vielversprechend als antiinfektive Mittel eingesetzt werden können. Peptide und Proteine aus Giften, die entwickelt wurden, um zelluläre und immunologische Prozesse bei Beutetieren und Räubern zu stören, besitzen auch von Natur aus antimikrobielle Eigenschaften. Das macht sie zu vielversprechenden Vorlagen für die Arzneimittelentwicklung.

Allerdings sind die herkömmlichen Entdeckungsverfahren, die auf biochemischer Isolation und funktionalem Screening basieren, durch die Komplexität der Giftmischungen und die Herausforderungen bei der Produktion größerer Biomoleküle eingeschränkt.

Die neuesten Fortschritte in der Omics-Technologie haben die Datenbanken von Giftproteinen erweitert und eine signifikante, aber ungenutzte molekulare Vielfalt offenbart. Diese Datensätze ermöglichen das rationale Design von giftinspirierenden Peptiden, indem sie strukturelle oder physikochemische Motive nachzeichnen, die für die biologische Aktivität entscheidend sind. Bioaktive Peptidfragmente können innerhalb größerer Toxin-Sequenzen verschlüsselt sein und zeigen erst nach ihrer Freisetzung Aktivität. Trotz dieses Potenzials bleibt die systematische in silico Extraktion und Validierung von antimikrobiellen Peptiden aus Giftsequenzen jedoch begrenzt.

Kardio-Toxine (CTXs) aus Naja-Arten, die zur Drei-Finger-Toxin-Familie gehören, sind besonders gut für die computergestützte Peptidentwicklung geeignet, da sie kompakte Größe, strukturelle Integrität und Membranbindungsfähigkeiten besitzen. Von kardio-ähnlichen basischen Proteinen (CLBPs), die strukturell verwandt sind, wurde in der antimikrobiellen Forschung jedoch weitgehend abgesehen.

Die Integration von KI mit Venomik ermöglicht nun eine schnelle Vorhersage des antimikrobiellen Potenzials und die Priorisierung potenziell bioaktiver Motive innerhalb von Sequenzdaten. Umfassende Ansätze, die die Toxinsequenzanalyse mit KI-gestützter Peptidentwicklung kombinieren, wurden jedoch nicht weit verbreitet umgesetzt. Lücken bestehen nach wie vor bei der in silico Identifizierung und Charakterisierung antimikrobieller Peptide aus Schlangengifttoxinen, insbesondere CTXs und CLBPs.

Sequenzanalyse, Design und funktionale Bewertung von aus CTX abgeleiteten Peptiden

Um neuartige antimikrobielle Peptide zu identifizieren, wurden 14 Kandidaten ausgewählt oder entworfen, basierend auf Sequenzanalysen und computergestützter Priorisierung aus den Kardio-Toxinen/Cytotoxinen von Naja (Kobra). Die Kandidatenpeptide wurden mit maschinellen Lernwerkzeugen zur Vorhersage antimikrobieller Peptide und Hämolyse bewertet, wobei das chemisch modifizierte CTX-p7 von einigen in silico Analysen ausgeschlossen wurde.

Die Peptide wurden mit Festphasen-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Chemie synthetisiert, ihre Reinheit wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bewertet und ihre Molekulargewichte wurden durch Massenspektrometrie (MS) bestätigt.

Die strukturellen Merkmale wurden mithilfe von AlphaFold2 zur Vorhersage der Proteinstruktur, der hölzernen Radialprojektionen zur Beurteilung der Amphipathizität und der kreisförmigen Dichroismus (CD)-Spektroskopie unter membranmimischen Bedingungen bewertet. Die antibakterielle Aktivität wurde durch Mikrodilutionstests gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien quantifiziert. Der Mikrodilutionstest wurde dreimal unabhängig wiederholt, wobei jede Analyse dreifach durchgeführt wurde. Die Membrandisruption wurde durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Fluoreszenzfärbemethoden untersucht.

Mechanistische Tests umfassten die Bewertung der Permeabilität der äußeren Bakterienmembran mittels des N-Phenyl-1-Naphthylamine (NPN) Aufnahme-Tests und die Depolarisation der inneren Bakterienmembran mithilfe des 3,3′-Dipropyldithiacarbocyanid-Iodids [DiSC3(5)]-Tests.

Von Giften inspirierte antimikrobielle Peptide

Um das Potenzial der Schlangengift-CTXs als Vorlagen für das Design von AMP zu erkunden, wurden CTX-Sequenzen von Naja-Arten aus öffentlichen Protein-Datenbanken abgerufen und auf Sequenzähnlichkeit analysiert. Der Sequenzvergleich ergab eine hohe Erhaltung, was darauf hindeutet, dass strukturelle und funktionale Motive erhalten geblieben sind.

Zwei Strategien leiteten die Auswahl der Kandidaten für aus CTX abgeleitete Peptidfragmente, die mit maschinellen Lernwerkzeugen zur AMP-Vorhersage priorisiert wurden. Die erste Strategie bestand darin, konservierte Regionen aus acht gut charakterisierten CTXs zu extrahieren und diese Fragmente mittels des Antimicrobial Peptide Activity (AMPA)-Algorithmus zu analysieren, was zu sieben nativen Peptiden führte; zwei weitere Derivate wurden dann aus CTX-p5 entworfen. Der zweite Ansatz generierte eine Konsenssequenz aus 92 Naja CTXs und verwendete sie zur Entwicklung von fünf zusätzlichen Peptiden, die auf konservierten Aminosäureresten basierten.

Der AMPA-Algorithmus identifizierte sieben potenzielle antimikrobielle Regionen. Weitere Bewertungen mit antimikrobiellen und hämolytischen Vorhersagewerkzeugen unterstützten ihre computergestützte Priorisierung, wobei insgesamt neun Peptide aus dieser Strategie stammten: sieben native CTX-abgeleitete Fragmente und zwei CTX-p5-Derivate, CTX-p6 (erhöhte Kationizität) und CTX-p7 (Palmitoylschwanz für Membraninteraktion). Der konsensbasierte Ansatz generierte fünf zusätzliche Peptide (CTX-p10–CTX-p14). Die meisten Peptide erhielten von mindestens zwei Modellen hohe antimikrobielle Bewertungen, obwohl die Ergebnisse zwischen den Algorithmen variierten.

Die in silico-physikochemische Analyse identifizierte CTX-p6 und CTX-p14 als die vielversprechendsten, gefolgt von CTX-p5 und CTX-p9, aber durch experimentelle Tests wurde später CTX-p5 als das aktivste Peptid identifiziert. CTX-p11 wies eine hohe Aggregationsneigung auf. Vierzehn Peptide wurden synthetisiert, wobei die HPLC eine Reinheit von über 95 % bestätigte und die Massenspektrometrie die erwarteten Molekulargewichte verifizierte.

Die strukturelle Analyse zeigte eine signifikante Diversität unter den von CTX inspirierten Peptiden. AlphaFold-Modellierung sagte eine teilweise helikale Neigung für mehrere voraus, aber dessen Zuverlässigkeit für kurze, flexible Sequenzen ist begrenzt. AlphaFold sagte teilweise gefaltete oder β-Haarpin-ähnliche Konformationen für einige Peptide voraus, während hölzerne Radialprojektionen separate theoretische Verteilungen von amphipathischen Rückständen zeigten, die von einer idealisierten α-Helix ausgingen. Diese theoretischen Projektionen stimmten nicht immer mit den Experimenten überein.

CD-Spektren zeigten, dass die meisten Peptide in wässriger Lösung ungeordnet waren, aber einige, einschließlich CTX-p1, CTX-p8, CTX-p11, CTX-p13 und CTX-p14, wiesen in membranmimischen Umgebungen α-helikale Signaturen auf. Die Deconvolution bestätigte, dass nur einige in diesen Bedingungen helikale Strukturen annahmen. Nur ein Teil der Peptide zeigte induzierbare helikale Merkmale, und Membrandisruption kann ohne stabile α-Helices auftreten. Die verwendeten SDS- und TFE-Bedingungen, um Strukturen zu induzieren, stellen nicht vollständig biologische Lipidmembranen nach.

Die 14 von CTX inspirierten Peptide wurden gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien getestet. Peptide mit messbarer Aktivität hatten minimale Hemmkonzentrationen (MICs) von 125–500 μM, während mehrere Kandidaten, hauptsächlich aus der konsensbasierten Strategie, bis zu 500 μM keine messbare Aktivität zeigten. CTX-p5 zeigte konstant die stärkste antibakterielle Aktivität und wurde für weitere Studien ausgewählt. Mikroskopische und biochemische Tests unterstützten einen membranzerstörenden Wirkmechanismus für CTX-p5, mit erhöhter Permeabilität und Depolarisation nach der Behandlung. Während die meisten Peptide schwach waren, zeigte CTX-p5 moderate antibakterielle und membranolytische Aktivität.

Die hämolytische Aktivität der von CTX inspirierten Peptide wurde an menschlichen roten Blutkörperchen (62,5–1000 μM) getestet. Die meisten Peptide verursachten bei niedrigen Konzentrationen wenig oder keine Hämolyse, während die Aktivität bei höheren Dosen anstieg. CTX-p7 zeigte die höchste hämolytische Aktivität, während CTX-p5 viel weniger verursachte. Insgesamt zeigten CTX-abgeleitete Peptide im Allgemeinen moderate bis niedrige Erythrozyten-Toxizität.

Schlussfolgerungen

Die aktuelle Studie bietet den Nachweis, dass die Integration von Toxinsequenzanalyse, computergestützter Vorhersage und experimenteller Validierung antimikrobielle Peptidkandidaten aus Schlangengift-Kardio-Toxinen identifizieren kann.

Obwohl maschinelles Lernen eine schnelle Priorisierung von Kandidaten ermöglichte, zeigten nur eine kleine Anzahl messbare antibakterielle Aktivität, was die Beschränkungen der aktuellen Vorhersagemethoden und den Wert der Berichterstattung über schwache oder inaktive Kandidaten verdeutlicht.

Die erforderlichen antibakteriellen Konzentrationen waren im Vergleich zu klinisch fortgeschrittenen antimikrobiellen Peptiden relativ hoch, was den übertragenen Wert dieser Kandidaten als direkte therapeutische Mittel derzeit einschränkt. Die Arbeit war eine frühe rechnergestützte und in vitro-Studie, und CTX-p5 wird weitere Verfeinerung erfordern, bevor es als therapeutischer Ansatz betrachtet werden kann.

Diese Herangehensweise auf andere von Gift abgeleitete Gerüste und molekulare Ziele auszuweiten, könnte die Entwicklung bioaktiver Peptidtherapeutika erweitern. Verbesserte KI-gesteuerte Analysen, Strukturvorhersagen und experimentelle Validierungen könnten helfen, die Eigenschaften von Peptiden zu verfeinern und die Entdeckung wirksamer, selektiver Antimikrobieller gegen antibiotikaresistente Krankheitserreger zu unterstützen.

Quellen: